ه شير شامل 40 نمونه از شير خام مخزن دامداريهاي طرف قرارداد با كارخانه هاي شير پاستوريزه مشهد و 28 نمونه شير پاستوريزه از همان كارخانه ها بوسيله كيت هاي جنتامايسين مورد آزمايش قرار گرفتند. نتايج نشان داد كه 6 نمونه شير خام و 2 نمونه شير پاستوريزه (11.76% از كل نمونه هاي شير خام و پاستوريزه)آلوده به جنتامايسين بوده و 60 نمونه (88.24% داراي باقيمانده جنتامايسين نبودند. در شيرهاي آلوده بالاترين غلظت آنتي بيوتيك در دامنه 63/0 الي 25/1 نانوگرم در ميلي ليتر شير بوده و حداقل غلظت آنتي بيوتيك در دامنه 3/0 الي 625/0 نانوگرم در ميلي ليتر قرار داشت. ميزان آنتي بيوتيك در شير خام و پاستوريزه تفاوت معني داري نداشت. (فلاح راد،1376)
عطاري باروق در سال 1375 ميزان آلودگي آنتي بيوتيك در شير را 3/53 درصد اعلام نمود نمونه هاي مورد آزمايش شير خام و روش مورد استفاده فوس تست60 بود.(باروق، 1375)
در سال 1373 منصوري نژند در كرمان با بررسي 80 نمونه شير دريافتي توسط كارخانه شير كرمان ميزان آلودگي شير خام را در فصل زمستان در منطقه 67.5درصد گزارش كرد در اين بررسي از كيت تشخيص سريع آنتي بيوتيكها در شير كه دقت آن 3 ميكروگرم در ميلي ليتر بود استفاده گرديد.(منصوري نژند،1373 )
در سال 1372 كريم و نواب پور ميزان آلودگي شير با استفاده از روش دلووتست را 52 درصد گزارش نمودند. (کريم،1372 )
عابدي شيرازي در سال 1363 ميزان آلودگي شير مصرفي شهر شيراز به بقاياي آنتي بيوتيك ها مورد مطالعه قرار داد كه در اين مطالعه از 800 نمونه شير خام و شير پاستوريزه كه 8 ماه با روش ديسك61 در شيراز مورد آزمايش قرار گرفت در 2.75درصد بقاياي آنتي بيوتيكها مشاهده گرديد.(شيرازي، 1363)

2-4.بررسي باقيمانده آنتي بيوتيک در تخم مرغ
در مطالعه اي كه توسط ال قمدي 62و همكاران(2000) در عربستان سعودي انجام شده است تركيبات تتراسايكلين باقيمانده در توليدات طيور شامل تخم مرغ، كبد مرغ، لاشه مرغ مورد بررسي قرار گرفته است. در اين مطالعه 33 لاشه(69.69 درصد) حاوي باقيمانده تتراسايكلين بودند همچنين ميزان تتراسايكلين در 4/14% از تخم مرغهاي خام فراتر از ميزان MRL بودند.
بسياري از آنتي بيوتيكها نظير تتراسيكلين، اكسي تتراسيكلين، كلرامفنيكل و آمپي سيلين از مرغ به تخم مرغهاي توليد شده منتقل مي شوند انتقال داروي انرو فلوكسازين خوراكي هم از طريق مرغ به تخم مرغ مشخص شده است بر اين اساس احسان زايرزاده و همكاران جهت بررسي ميزان باقيمانده انرو فلوكسازين در تخم مرغ به روش كروماتوگرافي مايع با عملكرد بالا، تعدا د 40 مرغ تخمگذار نژاد لگهورن را مورد بررسي قرار دادند. مرغها به طور تصادفي به 4 گروه 10 تايي تقسيم شدند. در گروه اول، دوم و سوم به ترتيب به ميزان mg/kg2، mg/kg 5 و mg/kg10 داروي انرو فلوكسازين به روش داخل عضلاني به هر مرغ تزريق شد. گروه چهارم هم به عنوان گروه كنترل در نظر گرفته شد. همه پرندگان به مدت 7 روز تحت آزمايش قرار گرفتند. در روزهاي 7-1 آزمايش و 3، 6، و 9 روز آخرين تزريق، تخم مرغهاي توليد شده 4 گانه جمع آوري شد و مورد آزمايش قرار گرفت. نمونه ها توسط دستگاه كروما توگرافي مايع با عملكرد بالا مورد آناليز قرار گرفتند. نتايج حاصل از مطالعه نشان داد كه در اثر افزايش دوز تزريقي انرو فلوكسازين، ميزان باقيمانده اين دارو در تخم مرغها افزايش يافت. علاوه براين ميزان باقيمانده دارويي در پايان تزريقات(روزهفتم) در هر سه گروه به بيشترين غلظت رسيد. همچنين ميزان باقيمانده دارويي در تخم مرغها در روز نهم پس از اتمام تزريقات در هر سه گروه به صفر رسيد. ولي در روز سوم و ششم در گروه سوم و در روز سوم در گروه دوم باقيمانده انرو فلوكسازين قابل تشخيص بود. در نهايت مي توان اين گونه نتيجه گيري كرد كه احتمالا كه هرچه ميزان دوز تجويز شده داروي انرو فلوكسازين براي درمان يا پيشگيري گله بيشتر باشد بايستي زمان آخرين تجويز دارو تا برداشت تخم مرغها افزايش پيدا كند تا تمام دارو دفع گردد و ميزان باقيمانده دارويي در تخم مرغ به حداقل برسد. باقيمانده آنتي بيوتيك اكثرا در انواع گوشت بويژه گوشت طيور و شير وجود دارد. مهم اين است كه اين مقدار باقيمانده از محدوده حداكثر مجاز تجاوز نكند.( زايرزاده،1384 )

فصل سوم
مواد و روشها

3-1. روش تعيين باقيمانده آنتي بيوتيک جنتامايسين درنمونه هاي گوشت مرغ
3-1-1.مواد ووسائل مورد نياز
* كيت تشخيص باقيمانده آنتي بيوتيک جنتامايسين بر پايه سيستم الايزا محصول شركت Europroxima شركت شيمي طب سينا كشور هلند مي باشد كه اصلي ترين مورد نياز تحقيق بوده که شامل مواد زير است:
– محلول استاندارد63 شامل 7 استاندارد به رقت هاي ng/ml 25/0، 5/0، 1، 5، 10 و 50
– رزين بافر64 جهت شستشو
– محلول سوبسترا65 (tetramethylbenzidine)
– محلول استاپ66 حاوي اسيد سولفوريك 5/0 مولار
– آنتي جنتامايسين67 و محلول کونژوگه68 آنزيمي ليوفيليزه به شكل سوسپانسيون
– ميکروتيتر پليت69 شامل 96 خانه يا چاهک مي باشد.
-Dilution buffer
* محلول SDB ( شامل: گرم5/0Na2HPO4= ، گرم2/0KCL= ، گرم2/0 KH2PO4= گرم30 , NaCL= 5/0) Tween 80 = در يک ليتر آب مقطرمي باشد )
* دستگاه الايزا

3-2.روش کار
3-2-1.آماده سازي نمونه
ابتدا 10 گرم از نمونه ها با آسياب برقي معمولي، هموژن شد و بعد 1 گرم از نمونه هموژن شده به داخل لوله هاي آزمايش ريخته و 6 ميلي ليتر محلول3% تري كلرو استيك به لوله ها اضافه شد و به مدت 5 دقيقه با ورتکس کاملا مخلوط گرديد و سپس به مدت 10 دقيقه با سرعت 2000 دور در دقيقه سانتريفوژ شدند بعد از اتمام سانتريفوژ، لايه چربي قسمت فوقاني لوله با سمپلر برداشته شد و سپس محتوي لوله توسط کاغذ صافي شماره يک واتمن، صاف گرديد و در نهايت، 150 لاندا از محلول صاف شده با 950 لاندا از محلول SDB با کمک ورتکس کاملا مخلوط گرديد.

3-2-2. آماده سازي محلول هاي موجود در کيت
* محلول شماره1: 4سي سي از buffer Dilution به محلول آنتي جنتامايسين اضافه گرديد.
* محلول شماره2: 4سي سي از بافر buffer Dilution به محلول کونژوگه اضافه گرديد.
استانداردهاي موجود در كيت 7 عدد است كه به ترتيب رقت روي ميزکار چيده شد. استانداردها با رقت هايng/ml 0-ng/ml 25/0 -ng/ml 5/0- ng/ml1 – ng/ml5- ng/ml 10- ng/ml50 به ترتيب در چاهكهاي ميکروتيترپليت ريخته شد به اين صورت که 100لاندا از استاندارد صفر در چاهك هايA1و A2و 50 لاندا از استاندارد صفر در دو چاهك بعدي) B1 و B2 ) ريخته شد و در چاهكهاي بعدي به ترتيب 50 لاندا از استاندارد هاي با رقت 25/0- 5/0- 1-5-10 و 50 ريخته و سپس 50 لاندا از مخلوط نمونه آماده شده به چاهكها اضافه گرديد سپس به همه خانه ها به جز 2 خانه اول(چاهك A1و A2) 25 لاندا از محلول شماره 1 ريخته شد و بعد 1 ساعت در يخچال و تاريكي (جهت انكوبه شدن) نگهداشته شد(در دماي 4 درجه) وبعد 25 لاندا از محلول شماره2 در همه خانه ها به جز 2 خانه اول (A1 و A2 )ريخته و باشيکرمخلوط گرديد و بعد ميکروتيتر پليت توسط دستگاه الايزا و رزين بافر موجود در كيت 2 بار شستشو داده شد(طبق برنامه اي كه به دستگاه داده مي شود) سپس 100لاندا سوبسترا به همه خانه ها اضافه كرده ،30 دقيقه در تاريكي در دماي 25-20 درجه(دماي اتاق) نگه داشته سپس100 لاندا از محلول استاپ به همه خانه هاي ميکرو تيتر پليت اضافه کرده ودر نهايت با دستگاه الايزا ريدربا طول موج 450 نانومترخوانده مي شود.

ميکرو تيتر پليت
با توجه با استانداردهاي موجود منحني کاليبراسيون به صورت زير مي باشد:

نمودار 3-1.منحني کاليبراسيون جنتامايسين

نتايج با توجه به فرمول زير بدست مي آيد:
OD نمونه
حداکثر جذب = 100 ×
OD استاندارد صفر

3-3.روش تعيين باقيمانده آنتي بيوتيک كلرامفنيكل درنمونه هاي گوشت مرغ
3-3-1 .مواد ووسائل مورد نياز :
* كيت تشخيص باقيمانده آنتي بيوتيک کلرامفنيکل بر پايه سيستم الايزا محصول شركت Europroxima شركت شيمي طب سينا كشور هلند مي باشد كه اصلي ترين مورد نياز تحقيق بوده که شامل مواد زير است:
– محلول استاندارد شامل 7 استاندارد به رقت هاي ng/m 025/0، 05/0، 1/0، 5/0 و 2
– رزين بافر جهت شستشو
– محلول سوبسترا(tetramethylbenzidine)
– محلول استاپ حاوي اسيد سولفوريك 5/0 مولار
– محلول کونژوگه70 آنزيمي ليوفيليزه به شكل سوسپانسيون
– ميکروتيتر پليت
-Dilution buffer
– محلول آنتي بادي71
-Reconstitution buffer
* محلول استات اتيل ( شرکت مرک )
* محلول ان هگزان ( شرکت مرک )
* تبخيرگر تحت گاز نيتروژن
* دستگاه الايزا) شرکت (Biotek ELXA

3-3-2 .روش کار
3-3-2-1آماده سازي نمونه:
10 گرم از نمونه ها با آسياب، هموژنيزه شد و 3 گرم از نمونه هموژنيزه شده به داخل لوله آزمايش منتقل گرديد و 6 سي سي محلول استات اتيل به آن ها افزوده شد و به مدت 10 دقيقه با سرعت 2000 دور سانتريفوژ شد و بعد 4سي سي ازمايع استات اتيل رويي به لوله شيشه اي مخصوص آزمايش منتقل شد و دردستگاه تبخير گر، تحت جريان ملايم گاز نيتروژن در دماي 50 درجه سانتي گراد تبخير و خشک گرديد سپس 1سي سي از بافر موجود در كيت (به نسبت 1به3 با آب مقطر رقيق شده ) و 1 سي سي هم محلول ان- هگزان به لوله ها اضافه شد ودر مرحله بعد به مدت 10 دقيقه با سرعت 2000 دور سانتريفوژو نهايتا لايه زيرين توسط سمپلر به لوله آزمايش ديگرمنتقل گرديد .
استانداردها به ترتيب رقت در چاهک هاي ميکروتيتر ريخته شد به اين صورت كه 100 لاندا(ميکرو ليتر) از بافرReconstitution buffer را بعنوان استاندارد صفر در چاهك هايA1 و A2 و50 لاندا هم از اين بافر در چاهك هاي B1 و B2 و 50 لاندا از استاندارد با رقت 025/0در دو چاهك بعدي و همينطور 50 لاندا از استانداردهاي با رقت 05/0 ، 1/0،2/0،5/0 و 2را بصورت دوبل(در 2 چاهك) ريخته شد و سپس 25 لاندا از محلول Cap-HRPO در تمام خانه ها به جز 2 خانه A1 و A2 (كه محتوي 100 لاندا بافر Reconstitution buffer مي باشد) ، ريخته و بعد 25 لاندا از محلول Anti-Cap به تمام خانه ها به جز 2 خانه A1 و A2 ، اضافه کرده و 1 دقيقه توسط دستگاه شيکر به صورت چرخشي تکان داده و بعد 1 ساعت در يخچال گذاشته شد.(دماي 4 درجه سانتي گراد)
سپس3 بار توسط دستگاه الايزا با محلول مخصوص شستشوي موجود در كيت، شستشو داده شد و در نهايت 100لاندا سوبسترا به همه خانه ها اضافه شدو 30 دقيقه در تاريكي نگه داشته و در پايان اين مرحله، واكنش رنگي صورت گرفته كه با افزودن محلول بازدارنده (محلول استاپ) به مقدار 100ميكروليتر، به هر يك از چاهك ها رنگ آبي به زرد تغيير يافت. محلول پليت ها با قرائت گر الايزا در طول موج 450 نانومتر خوانده شد و اطلاعات مربوط به ميزان جذب72 هر چاهك به تفكيك مشخص گرديد. اين اطلاعات شامل ميزان جذب در استانداردها و چاهك هاي نمونه و غلظت کلرامفنيکل بر حسب نانو گرم در ميلي ليتر براي نمونه هاي مثبت بود.

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید