آنها يكسان باشد تا از خطاي مربوط به تفاوت در قدرت اتصال پليت ها جلوگيري شود و ترجيحا بافر كوتينگ و زمان كوتينگ و محلول آنتي ژني آماده شده براي كوتينگ بهتر است يكسان باشند.
ب) اتصالات برقرار شده بين آنتي ژن و بستر جامد بايد به اندازه كافي محكم و قوي باشند تا در مراحل شستشوي بعدي كنده نشوند، معمولا براي آنتي ژن هاي عادي، اتصال دهنده اضافي لازم نيست ولي اگر آنتي ژني استثنائاً با روش معمول به كف پليت نچسبيد يا اتصالات سستي برقرار كرد از مواد و روش هاي خاصي براي اتصال آنتي ژن به كف بستر استفاده مي شود. (مثلاً استفاده از گلوتارآلدئيد يا اشعه ايكس)
ج) پروتئين متصل شده نبايد آنقدر كم باشد كه نتواند مقادير بالاي آنتي بادي را جذب كند در اين صورت غلظت هاي بالاي آنتي بادي قابل تشخيص نخواهد بود از طرفي پروتئين متصل شده نبايد آنقدر زياد باشد كه اتصالات غيراختصاصي از اتصالات اختصاصي بيشتر شوند كه در اين صورت جواب آزمايش قابل اغتماد نخواهد بود.
درمرحله دوم، نقاطي از كف پليت كه با پروتئين اختصاصي پوشانده نشده اند با استفاده از محلول هاي پروتئيني خنثي (از اين نظر كه در واكنش اختصاصي بعدي اثر سوئي ندارد) پوشانده مي شوند محلول هاي پروتئيني براي اين منظور حاوي شير کم چربي يا آلبومين گاوي يا ژلاتين و يا کازئين ميباشند. علاوه بر پروتئين از دترژانت هاي غير يوني خاصي نظير Tween 20 يا Tween 80 نيز به عنوان كمكي استفاده مي شوند نوع اين مواد و مقادير بكار برده شده به صورت تجربي تعيين مي شوند و با توجه به تجربيات ديگران مي توان محدوده خاصي را براي كار مورد نظر امتحان كرد و بهترين غلظت را بدست آورد (چون پروتئين ها از ريشه هاي جانبي متفاوتي برخوردارند لذا براي پروتئين هاي بسيار خالص مثل پروتئين هاي ريكامبينانت مناسب سازي اين تركيبات در بالا بردن اعتبار نتايج بسيار كمك كننده خواهد بود). علاوه بر پروتئين و دترژانت، غلظت يوني بافر بلوك كننده نيز اهميت زيادي دارد و براي اتصال انتخابي پروتئين مورد نظر (از ميان مخلوط پروتئيني) ميتوان بافرهاي مختلف و غلظت يوني متفاوت را ارزيابي كرده و بهترين بافر را براي آزمايش مورد نظر بدست آورد.
درمرحله سوم، محلول مورد آزمايش كه احتمال ميرود حاوي مقادير قابل رديابي از آنتي بادي بر عليه آنتي ژن اختصاصي موجود در كف پليت باشد در اين مرحله در بافر مناسبي تهيه شده و اضافه ميگرددو آنتي بادي شناور در محلول، آنتي ژن متصل به بستر را پيدا كرده و به آن متصل مي شود بندرت اين آنتي بادي متصل به آنزيم است اما در اغلب اوقات كونژوگه آنزيم دار در مرحله بعدي بكار گرفته مي شود.
آنتي بادي هاي متصل نشده با عمل شستشو از محيط حذف مي شوند بافر شستشو معمولا داراي پروتئين خنثي به كار گرفته شده در محلول بلوكان است و از نظر قدرت و pH بافري مناسب براي اتصال آنتي ژن با آنتي بادي است. آنتي بادي ها، سرم و محلولهاي بكار گرفته شده در مراحل مختلف الايزا معمولا در بافر شستشو رقيق مي شوند.
درمرحله چهارم، سيستم تقويتي اوليه قبل از سيستم تقويتي اصلي (كه همانا بكار گرفتن خصوصيت آنزيمهاست) ميباشد در اين مرحله ما واكنش هاي اضافه تري را به كار ميگيريم تا قدرت اندازه گيري تست (حساسيت و اختصاصيت) بالا برده شود.
بدين منظور از قدرت تقويت كنندگي بيوتين-آويدين، بيوتين- استرپتاويدين استفاده مي شود.
در آخرين مرحله، هر آنزيمي بر روي سوبستراي اختصاصي خود اثر كرده و آنرا به محصول تبديل مي كند اين واكنش در طي زمان منجر به جمع شدن مقدار متنابهي از محصول در محيط مي شود بدين معني كه با گذشت زمان معيني يك مولكول آنزيم مي تواند مولكول هاي سوبستراي بسياري را به محصول تبديل كند اين اثر افزايشي در حقيقت اساس الايزا را تشكيل ميدهد. بدين ترتيب كه آنتي بادي نهايي باقي مانده پس از شستشوي نهايي با مولكول آنزيم متصل است و افزودن سوبسترا در طي زمان معيني (مثلاً يك ساعت) منجر به آزاد سازي مقادير متنابهي سوبسترا مي گردد كه يا خود رنگي ميباشد يا در واكنش با ماده ديگري (كروموژن يا رنگزا) كه به محيط اضافه شده است رنگ توليد ميكند در نهايت رنگ توليد شده توسط دستگاه قرائت كننده مخصوصي خوانده شده و محاسبات لازم بر روي داده هاي بدست آمده انجام مي گيرد. روشهاي متفاوت بكار گرفته شده توسط پژوهشگران مختلف جهت اندازه گيري ميزان بقاياي مواد آنتي بيوتيکي در غذاها مي تواند روي نتايج بدست آمده اثر داشته باشد. بين روش هاي ذکر شده روش الايزا به دليل سرعت اندازه گيري، حساسيت بالا، راحتي اندازه گيري و مقرون به صرفه بودن آن کاربرد زيادتري دارد. (عبداللهي،1383)
با توجه به توضيحات فوق، جهت بررسي ميزان باقيمانده آنتي بيوتيکهاي کلرامفنيکل و جنتامايسين درگوشتهاي مرغ عرضه شده درفروشگاهها و مراکزتوزيع گوشت طيور در سطح شهرستان هاي سمنان، گرمسار و دامغان وهمچنين بررسي تاثير فرايند انجماد (دماي20- درجه سانتي گراد) بر روي نمونه هاي آلوده، از روش الايزا استفاده شد.

1-10.اهداف تحقيق
هدف از اين تحقيق بررسي گوشت مرغ عرضه شده درفروشگاهها و مراکزتوزيع گوشت طيور در سطح شهرستان هاي سمنان، گرمسار و دامغان از نظر حضور يا عدم حضور باقيمانده آنتي بيوتيك هاي کلرامفنيکل و جنتامايسين است. نتايج به دست آمده ضمن روشن نمودن وضعيت موجود مي تواند براي سازمان هاي ذينفع قابل استفاده باشد به طوريکه مسئولان بهداشتي نظارت دقيقتري در امور مرغداري ها و نحوه استفاده از آنتي بيوتيک ها داشته باشند. لازم به ذکر است، در زمان انجام پروژه به دليل عدم دسترسي به دو کيت آنتي بيوتيک استرپتومايسين و فورازوليدون ، آزمايشات مورد نظر انجام نشد.
فصل دوم
بررسي منابع

2-1.بررسي باقيمانده آنتي بيوتيک در گوشت ماکيان
شالابي29 و همكاران(2011) ميزان باقيمانده تتراسيكلين را در عضله و جگر جوجه بررسي نمودند.آنها اعتبار روش كروماتوگرافي مايع با کارآيي بالا30 و دتكتور ديور را براي سنجش باقيمانده تتراسيكلين در عضله و جگر جوجه ارزيابي نمودند. نتايج آنها نشان داد كه روش HPLC- DAD بخوبي مي تواند براي سنجش باقيمانده تتراسيكلين در عضله جوجه و جگر آن مورد استفاده قرار بگيرد.
جينكينگ31 و همكاران(2011) با استفاده از روش الايزا ميزان باقيمانده آنتي بيوتيك نوروفلوكساسين را در كبد جوجه اندازه گيري نمودند. آنتي ژن مصنوعي NFLXBSA بوسيله روش كربودي آميد استري سنتز شد. نتايج آنها نشان داد كه الايزا مي تواند براي غربالگري باقيمانده NFLX در جگر جوجه استفاده شود.
تاجيك32 و همكاران(2010) باقيمانده هاي كلرامفنيكل را در عضله، كليه و جگر جوجه اندازه گيري نمودند. و مقايسه اي مابين روشهاي پايش باقيمانده هاي آنتي باكتريال با رو ش هاي پليت تست الايزا و HPLC انجام دادند. تعداد 160 لاشه جوجه از 3 استان ايران جمع آوري نمودند. تست فور پليت(FPT)، الايزا و HPLC براي تعيين كمي و كيفي آلودگي نمونه ها استفاده شد. نتايج روش FPT نشان داد كه 17.5% با آنتي بيوتيك آلوده بودند. نتايج الايزا نشان داد كه 28 نمونه مثبت بودند. در روش FPT مشخص شد كه 22 نمونه جگر، 21 نمونه كليه و 14 نمونه عضله از نظر باقيمانده كلرامفنيكل مثبت بودند. سنجش الايزا نشان داد كه مقدار مينيمم و ماكزيمم به ترتيب 54/0 و ng/g 155.2 در نمونه كليه و جگر بدست آمد. روش HPLC يافته هاي روش الايزا را تصديق نمود اگرچه در سطح آلودگي كمتر از روش الايزا بود. اين پژوهش نشان داد كه با وجود آنكه كاربرد كلرامفنيكل در غذاي حيواني شامل ماكيان منع شده است اما باقيمانده كلرامفنيكل نشان داده استفاده غير قانوني اين آنتي بيوتيك در مواد غذايي هست. همچنين نتايج آنها نشان داد كه آزمايشات سنجش اختصاصي در غربالگري و تعيين كميت باقيمانده كلرامفنيكل در فرآورده هاي غذايي بسيار با اهميت است.
اولجينيك33 و همكاران(2009) از روش كروماتوگرافي مايع به همراه اسپكترومتر جرمي براي تعيين مقدار باقيمانده كوكسيدواستات در جگر جوجه استفاده نمودند. اينها شامل آنتي بيوتيكهاي يونوفور(لازالوسيد، مادورامايسين، مونزنين، نارازين، سالينومايسين) و كوكسيدواستاتهاي شيميايي(كلازوريل، دكوكوئيسنات، ديكلازوريل، نيكربازين و روبرونيدين) بودند. اما نتايج نشان داد كه روش LC_MS/MS روش مناسبي براي تعيين كميت دقيق كوكسيدو استات نمي باشد.
وانگ34 وهمكاران (2009) ميزان باقيمانده نئومايسين را در عضله خوك، عضله جوجه، تخم مرغ، ماهي، شير به روش الايزا اندازه گيري نمودند. با استفاده از روش الايزا و آنتي بادي پلي كلونال باقيمانده نئومايسين در مواد غذايي حيواني تعيين گرديد. حد تشخيص براي عضله خوك، جوجه، ماهي و شير برابر µg/kg5 و در كليه µg/kg10 برابر و در تخم مرغ برابر µg/kg 20 بود. نتايج نشان داد كه روش الايزا در مقايسه با HPLC به خوبي مي تواند براي ارزيابي باقيمانده آنتي بيوتيك نئومايسين بكار رود.
ميراندا و همكاران(2009) در طي پژوهشي در اسپانيا كه براي اندازه گيري همزمان انواع تتراسايكلين ها در عضلات طيور بر روي 24 نمونه از ران مرغهاي تجاري صورت گرفت اظهار داشتند كه در 9 نمونه (37.5درصد) از ران هاي مورد بررسي، تتراسايكلين شناسايي شده و در 7 نمونه، اكسي تتراسايكلين وجود داشت.
جونگسيا چن35و همكاران (2009) از روش الايزا براي تشخيص انروفلوكساسين در عضله جوجه استفاده نمودند. نتايج حاصل ،مشابه نتايج بدست آمده از روش HPLC بودو نشان داد كه الايزا يك متد مناسب براي غربالگري باقيمانده داروهاي حيواني مي باشد.
تاجيك و همكاران (2006) با مطالعه بر روي عضله جوجه ها در استان مازندران و با استفاده از روش كروماتو گرافي مشخص نموده اند كه بيش از 50% از نمونه گوشت جوجه ها داراي مقدار قابل ملاحظه اي از آنتي بيوتيك مي باشند.
كبير36وهمكاران (2004) شيوع باقيمانده داروهاي حيواني را در فرآورده هاي يکي از ايالتهاي نيجريه ارزيابي نمودند. اطلاعات دارويي نمونه ها بطور هفتگي و بمدت 10 هفته جمع آوري شد. در اين آزمايش 200 تخم مرغ تجاري و 378 نمونه لاشه جوحه پس از كشتار به منظور تعيين باقيمانده داروهاي آنتي باكتريال با استفاده از تست بازدارندگي ميكربي باسيلوس سرئوس ATCC11778 و ميكروكوكوس لوتئوس ATCC9341 مورد استفاده قرار گرفت. در 10 مزرعه مورد نظر از يك دارو استفاده نمودند. شيوع باقيمانده دارو در لاشه جوجه 4.8% بود. همچنين اين محققين بر اين باورند كه بر اساس نتايج تحقيقات، جوجه هاي گوشتي ميزان بيشتري(33.1درصد) از باقيمانده هاي داروهاي آنتي بيوتيكي نسبت به مرغهاي تخمگذار(23.6 درصد)و مرغ هاي محلي(4.8 درصد) را نشان مي دهند.
الاحوال37 و همكاران (1998) تحقيقي در مصر انجام دادند كه در اين تحقيق ميزان باقيمانده تتراسايكلين در ارگان هاي بدن طيور و بافتهاي آن تعيين گرديد. از 50 نمونه كه بصورت اتفاقي از فروشگاههاي محلي تهيه شدند فقط 2 نمونه كبد (4 درصد) و 5 نمونه كليه (10درصد) حاوي باقيمانده تتراسايكلين بودند و هيچ باقيمانده آنتي بيوتيكي در هيچكدام از نمونه هاي سينه و ران شناسايي نشد.
الاحوال و همكاران (1998) در همين زمينه، مطالعه ديگري بر روي جوجه هاي گوشتي با استفاده از روش HPLC در بلژيك انجام دادند كه در اين مطالعه، مقادير باقيمانده تتراسايكلين ها در جوجه هاي گوشتي بعد از تجويز خوراكي اندازه گيري شد. در اين مطالعه جوجه هاي گوشتي به مدت 5 روز متوالي با تتراسايكلين به مقدار 480 نانوگرم در كيلو گرم درمان شدند 4 روز پس از قطع دارو ميانگين مقادير

دسته بندی : No category

دیدگاهتان را بنویسید